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Western Blot常见问题分析

背景值高 膜没有均匀浸润 PVDF 膜转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿,转膜前用缓冲液浸泡10min
膜或者缓冲液污染 拿取膜与吸水纸时要戴手套,更换新鲜转膜缓冲液
封闭不充分 更换封闭液或延长封闭时间
抗体与封闭液出现交叉反应 检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应
抗体浓度过高 做预实验检测确定一抗、二抗的最佳工作浓度
杂带多 一抗不是唯一特异的 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点制备抗体
二抗出现非特异性结合 设立不加一抗,只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合
不同的剪接体 选取抗原特异区域进行免疫
无信号或信号弱 抗体不适合于WB 设置阳性对照和内参蛋白
抗体浓度太低 加大抗体浓度
抗体保存不当 分装保存,避免反复冻融
抗原不充足 增加蛋白上样量
膜漂洗过度 减少漂洗的时间和次数
转膜不充分 延长转膜时间或增大转膜电压


 
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