技术支持
各种细胞传代的方法＆操作(细胞传代,细胞系)
点击下载附件附件
各种细胞传代的方法＆操作(细胞传代,细胞系)
1.当细胞铺满整个平皿(100mm)后,吸弃旧培养液，10mLPBS洗一遍
2.0.25%胰酶（预热20分钟左右）2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落（或在显微镜下观察细胞之间分离），立刻加5ml(DMEM+10%FBS)终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞。
3.离心1000rpm*5min,弃上清，加DMEM+10%FBS轻柔吹打。
4.将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml(DMEM+10%FBS)培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液。
小鼠ES-R1细胞系传代。
因为我们用饲养层细胞铺皿而不是明胶包被，所以传代之前必须处理饲养层细胞。
1.饲养层细胞STO处理：当STO铺满平皿后，向培养液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作时不要接触，作用是抑制STO增殖)，轻轻摇晃平皿，保证分布均匀，放置于培养箱中处理2h后，吸弃培养液，10mlPBS洗两遍（目的是把mitomycinC洗净），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)终止，离心1000rpm*5min弃上清，加DMEM+10%FBS后吹打均匀，种到新的100mm细胞培养皿，补齐培养液至10ml。置于培养箱中过夜。
2.第二天早上传干细胞：
（1）吸弃旧培养液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，边消化边轻轻晃动培养皿，4-5min后镜下观察发现发部分细胞脱落，成小的细胞团块，加8ml DMEM+10%FBS终止消化，轻柔吹打。
（2）然后将液体转移到15ml塑料离心管中，静置10-15min，吸弃上清，加2mlES培养液。
（3）将滴管在酒精灯下拉成非常细的玻璃管，吹打1－2次，尽量将ES吹散
（4）将前一天铺好的STO的培养液吸弃，换成10ml的ES培养液（操作要小心，不然STO很容易脱落），再把塑料离心管中的ES1:3或1:4(视情况而定)传到铺好的STO皿中，前后左右垂直晃动几下，使干细胞分布均匀，置于培养箱中，每天换液，两到三天传代。
应该注意的问题：
1.STO不管是在ES传代是换液过程中都可能因为加液体速度过快而脱落，所以最好靠近培养皿壁先一滴一滴加，避免液体直接打在STO上。
2.玻璃管拉得尽量细一些。
3.一定要把mitomycin洗干净
1.当细胞铺满整个平皿(100mm)后,吸弃旧培养液，10mLPBS洗一遍
2.0.25%胰酶（预热20分钟左右）2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落（或在显微镜下观察细胞之间分离），立刻加5ml(DMEM+10%FBS)终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞。
3.离心1000rpm*5min,弃上清，加DMEM+10%FBS轻柔吹打。
4.将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml(DMEM+10%FBS)培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液。
小鼠ES-R1细胞系传代。
因为我们用饲养层细胞铺皿而不是明胶包被，所以传代之前必须处理饲养层细胞。
1.饲养层细胞STO处理：当STO铺满平皿后，向培养液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作时不要接触，作用是抑制STO增殖)，轻轻摇晃平皿，保证分布均匀，放置于培养箱中处理2h后，吸弃培养液，10mlPBS洗两遍（目的是把mitomycinC洗净），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)终止，离心1000rpm*5min弃上清，加DMEM+10%FBS后吹打均匀，种到新的100mm细胞培养皿，补齐培养液至10ml。置于培养箱中过夜。
2.第二天早上传干细胞：
（1）吸弃旧培养液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，边消化边轻轻晃动培养皿，4-5min后镜下观察发现发部分细胞脱落，成小的细胞团块，加8ml DMEM+10%FBS终止消化，轻柔吹打。
（2）然后将液体转移到15ml塑料离心管中，静置10-15min，吸弃上清，加2mlES培养液。
（3）将滴管在酒精灯下拉成非常细的玻璃管，吹打1－2次，尽量将ES吹散
（4）将前一天铺好的STO的培养液吸弃，换成10ml的ES培养液（操作要小心，不然STO很容易脱落），再把塑料离心管中的ES1:3或1:4(视情况而定)传到铺好的STO皿中，前后左右垂直晃动几下，使干细胞分布均匀，置于培养箱中，每天换液，两到三天传代。
应该注意的问题：
1.STO不管是在ES传代是换液过程中都可能因为加液体速度过快而脱落，所以最好靠近培养皿壁先一滴一滴加，避免液体直接打在STO上。
2.玻璃管拉得尽量细一些。
3.一定要把mitomycin洗干净